Fertility and Sterility · Volumen 92 · Número 6 · 2009
Incubar o congelar el semen aumentó la fragmentación del ADN
Un laboratorio de Barcelona midió la fragmentación del ADN espermático antes y después de dejar el semen a temperatura ambiente, y antes y después de congelarlo y descongelarlo. En los dos experimentos subió. El estudio no mide fecundación, calidad embrionaria ni embarazo.
«Processing of semen can result in increased sperm DNA fragmentation»
La pregunta
Incubación, congelación e integridad del ADN espermático
Preparar el semen para reproducción asistida lleva varios pasos: licuefacción, retirada del plasma seminal por centrifugación, incubación y, a veces, congelación. Algunas muestras pasan horas en el laboratorio antes de procesarse.
Los autores recuerdan que la incubación se ha asociado al ataque de los radicales de oxígeno sobre los lípidos de la membrana, con pérdida de movilidad y de capacidad fecundante. También que la descongelación aumenta la producción de radicales de oxígeno.
Sobre el ADN, los trabajos previos no coinciden: unos ven más fragmentación tras descongelar y otros no. Según los autores, nadie había estudiado de forma sistemática el efecto del procesado sobre la integridad del ADN espermático.
¿Aumenta la fragmentación del ADN espermático al incubar el semen a temperatura ambiente, o al congelarlo y descongelarlo?
Los resultados
El índice de fragmentación subió tras la incubación y tras la descongelación
Todas las cifras son el índice de fragmentación del ADN (DFI): el porcentaje de espermatozoides con el ADN fragmentado, medido con TUNEL. El artículo considera anormal un DFI del 20 % o más. Son medias de muestras pareadas, antes y después.
DFI medio antes y después de cada procesado
Escala lineal que empieza en cero; la línea discontinua marca el umbral del 20 % que usa el artículo. Los tres bloques son grupos de muestras distintos y no forman una serie temporal: el grupo de 24 h y el de 2 y 4 h parten de valores basales diferentes.
Dispersión entre muestras. Los valores individuales del grupo de 24 h fueron de 5,1 a 66,3 % en fresco y de 7,6 a 85,7 % tras la incubación; en el de congelación, de 2,63 a 74,8 % en fresco y de 6,42 a 61 % tras descongelar. Otras comparaciones. Tras 24 h de incubación, el DFI fue superior al de las 2 y 4 h (P = 0,041 y P = 0,05, Wilcoxon), comparación que el artículo hace entre grupos de muestras distintos. En 4 de las 24 muestras incubadas 24 h y en 1 de las 8 incubadas 4 h, el DFI pasó de normal a anormal.
| Otros análisis del artículo | Resultado | P |
|---|---|---|
| Células redondas en fresco y DFI en fresco, incubación (Spearman) | r = 0,183 | 0,391 |
| Células redondas en fresco y DFI tras incubar (Spearman) | r = 0,157 | 0,463 |
| Células redondas en fresco y DFI en fresco, congelación (Pearson) | r = 0,056 | 0,646 |
| Células redondas en fresco y DFI tras descongelar (Pearson; datos no mostrados) | r = 0,296 | 0,013 |
| Aumento de inmóviles y aumento del DFI tras descongelar (Pearson) | r = 0,126 | 0,3 |
| Astenozoospermia en fresco: DFI anormal frente a normal, congelación (Fisher; datos no mostrados) | 73,3 % frente a 38,2 % | 0,02038 |
La única correlación significativa con las células redondas apareció tras descongelar a 37 °C, y no durante la incubación a temperatura ambiente. En el experimento de incubación, los autores no encontraron diferencias en los parámetros seminales entre muestras con DFI normal y anormal.
Lo que no cuadra dentro del artículo
- El experimento de congelación tiene 70 muestras en Métodos y en Resultados, y 72 en el pie de la Figura 1C. Esta ficha usa la cifra del texto, 70.
- El texto expresa 30 de 70 como 42,8 %. La ficha da el recuento.
- El texto escribe que la edad media
osciló entre 29 y 60 años
y que los DFI medios en frescooscilaron
entre 5,1 y 66,3 %. Una media no tiene rango: parecen valores individuales, y así se presentan aquí. - El DFI a las 24 h se presenta como significativamente mayor que a las 4 h con P = 0,05, cuando el umbral declarado en Métodos es P < 0,05.
- Las muestras son pareadas, pero Métodos cita también pruebas para muestras independientes (U de Mann-Whitney y t de Student, sin indicar si es pareada).
- La astenozoospermia fue más frecuente en las muestras con DFI anormal en el experimento de congelación, con datos no mostrados; en el de incubación, la diferencia no fue significativa.
El método, en cuatro pasos
Cada muestra se midió antes y después del procesado
Quién entró
102 varones con exploración física normal, de entre 29 y 60 años según el texto, con aprobación del comité ético.
Muestra por masturbación tras 2 a 5 días de abstinencia. Seminograma según la OMS, morfología por criterio estricto de Tygerberg (corte del 4 %) y células redondas por microscopía de contraste de fases.
Experimento 1: incubación
32 muestras a temperatura ambiente. En 24, una alícuota se analizó en fresco y otra tras 24 h de incubación.
Otras 8 muestras distintas se analizaron a las 0, 2 y 4 h.
Experimento 2: congelación
Alícuotas de 0,5 mL en medio Test Yolk Buffer, expuestas a vapores de nitrógeno líquido y guardadas en nitrógeno líquido.
A las 24 h se descongelaron a 37 °C y se repitió el análisis.
Qué se midió
Fragmentación del ADN con TUNEL, leída por citometría de flujo. El DFI es el porcentaje de espermatozoides con ADN fragmentado; del 20 % en adelante, anormal.
Comparaciones con Wilcoxon, Friedman, U de Mann-Whitney y t de Student.
La letra pequeña
Lo que matizan los propios autores
Es una comunicación breve, publicada como carta, sin apartado de limitaciones. Los autores matizan su hallazgo en el propio texto.
Hallazgo y mecanismo, en condicional
Escriben que el procesado del semen puede dar lugar
a más fragmentación del ADN. Del aumento durante la incubación dicen que es coherente
con el daño por radicales de oxígeno, y entre las células redondas señalan a los leucocitos como las más probables
responsables del aumento tras descongelar. Que la correlación con las células redondas apareciera a 37 °C y no a temperatura ambiente podría explicarse, al menos en parte
, por la sensibilidad de la peroxidación lipídica a la temperatura.
Astenozoospermia: hace falta una serie mayor
En el experimento de incubación el aumento no fue significativo, por lo que debería estudiarse una serie de casos mayor para confirmar estos datos
.
La congelación, en estudio
Cierran indicando que tienen en marcha estudios para probar métodos de criopreservación que reduzcan el daño en el ADN espermático.
Financiación y conflictos
Los siete autores declaran no tener nada que declarar. El artículo no indica fuente de financiación. Todos pertenecen a Institut Marquès, Fundación Leonardo Marquès o Center for Embryo Medicine.
«En conclusión, el procesado del semen para reproducción asistida, incluidas su incubación y su criopreservación, puede dar lugar a un aumento de la fragmentación del ADN espermático. Por tanto, debe evitarse la incubación innecesaria del semen en el laboratorio.»
«In conclusion, processing of semen for ART, including incubation and cryopreservation of semen, may result in increased sperm DNA fragmentation. Therefore, unnecessary incubation of semen in the laboratory should be avoided.»
Toro E, Fernández S, Colomar A, Casanovas A, Álvarez JG, López-Teijón M, Velilla E. Fertility and Sterility, 2009. Conclusión del artículo.Para citarlo
La referencia
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Código AdrIA · serie «papers legibles»
